본명은 새뮤얼 랭혼 클레멘스이며 마크 트웨인은 필명이다. 1835년 미국 미주리주 플로리다에서 치안판사인 존 마셜 클레멘스와 제인 램프턴의 4남 2녀 중 막내로 태어났다. 12세가 되던 1847년에 아버지가 사망하자 지방 신문사에서 견습 식자공으로 일을 시작했다. 17세가 되던 1852년에 보스턴의 주간신문에 「무단 거주자를 위협한 댄디」라는 콩트를 발표하는 등 그는 젊은 시절부터 소설 창작에 뜻을 두었다. 제대로 된 학교 교육을 받지 못한 그는 주로 공립 도서관에서 닥치는 대로 책을 읽으며 독학으로 지식을 쌓았다. 1857년부터 1961년까지 미시시피강 수로 안내인 일을 했으며 이때의 경험과 미시시피강에서 뛰놀던 어린 시절이 그의 창작 활동에 큰 영향을 미쳤다.
그는 1867년에 단편집 『캘리베러스군(郡)의 명물, 뛰어오르는 개구리』를 발표했지만, 그가 작가로서 명성을 날리게 된 것은 1876년에 내놓은 『톰 소여의 모험』 덕분이며, 1884년에 내놓은 후속작 『허클베리 핀의 모험』은 그를 위대한 작가의 반열에 올려놓았다. 『톰 소여의 모험』 은 아이들 정서에 맞지 않는다는 이유로 금서로 지정되거나 판매 금지가 되기도 했으나 현재는 미국 문학의 대표작으로 꼽힌다. 수차례 영화, 연극, 발레, 만화 등으로 각색됐고, 지금도 전 세계에서 명작으로 사랑받고 있다. 그는 작품 활동 외에도 제국주의 비판 활동, 여권 신장 운동에도 열심이었으며 노예제도 폐지를 적극 지지했다.
아내와 자식들을 병으로 일찍 떠나보내고 가족을 잃은 슬픔에 우울증에 시달리다가 1910년 4월 21일 심장마비로 세상을 떠났다.